Le basi chimiche dell'ereditarietà

CHE COS'E' IL DNA?

Partiamo dal principio!
La sigla DNA corrisponde all'acido deossiribonucleico. E' il materiale ereditario che si trova all'interno del nucleo delle cellule di tutti gli essere viventi. Può essere considerato come un pezzo dei blocchetti che compongono un corpo. Il DNA contenuto nel nucleo viene chiamato nucleare. Non è da dimenticare però che una piccola porzione del DNA si trova all'interno dei mitocondri; da questi prende il nome di DNA mitocondriale.

Da cosa è formato il DNA?

Alla base del DNA però stanno i nucleotidi.
Ogni nucleotide è composto da una base azotata, da uno zucchero a 5 atomi di carbonio (chiamato deossiribosio) e da un gruppo fosfato.
Vi sono due tipi di basi azotate: le purine (che presentano una struttura a due anelli) e le piramidine (che hanno un solo anello). Quindi il DNA è costituito da quattro diversi tipi di nucleotidi; essi differiscono soltanto per il tipo di purina e piramidina. I nucleotidi sono disposti in due filamenti che formano una spirale chiamata doppia elica. (Sulla doppia elica ci sarebbe da parlare a lungo dato la "diatriba" che si è creata, ma questa è un'altra storia!).

Come già si può intuire dalla foto il DNA è formato da quattro basi chimiche:

• Adenina (A); (purina)
• Guanina (G); (putina)
• Citosina (C); (piramidina)
• Timina (T). (piramidina)

Il DNA negli esseri umani contiene circa 3 miliardi di basi ( A con T e G con C).

MA COME SIAMO ARRIVATI AL DNA?

Ma come siamo arrivati al DNA? Chi mai ha pensato di studiare tutto questo? La storia è lunga! Cerchiamo di riassumerla in breve.

G. Mendel (1822-1884)





• Tutto cominciò nel 1857 quando il monaco G. Mendel pose le basi della genetica. Egli condusse un luuuungo esperimento, durato circa 8 anni, coinvolgendo più di migliaia piante di piselli. Egli diede l'idea base dell'ereditarietà. 

P. Levene (1869-1940)

• Nel 1929 P. Levene identificò i costituenti di una molecola di DNA. Egli dimostrò che le componenti del DNA erano collegate nell'ordine fosfato-zucchero-base. Definì ognuna di questi come nucleotidi e, inoltre, suggerì che una molecola di DNA è costituita da nucleotidi legati insieme attraverso gruppi fosfato. Tuttavia, egli pensò che la catena era breve e che le basi fossero ripetute tutte nello stesso ordine fisso.   

O. Avery (1877-1955)

• Dopo ricerche durate anche dieci anni condotte sui batteri, nel 1943 O. Avery ( insieme con i suo collaboratori) arrivarono alla conclusione che il materiale genetico della cellula fosse il DNA. Questa scoperta fu riconosciuta solo successivamente perché si pensava che il DNA (formato da quattro diversi nucleotidi) era troppo semplice per eseguire il compito enormemente complesso di portare l'informazione ereditaria. 

R. Franklin (1920-1958), J. Watson (1928), F. Crick (1916-2004)

• Successivamente R. Franklin, ricercatrice, osservando i raggi X si accorsero che il modello mostrava due pioli; scoprì così PER PRIMA che il DNA aveva forma elicoidale. La loro scoperta fu però "rubata" da Watson e Chrick, che nel 1953, osservando gli appunti che la Franklin aveva messo insieme nel tempo, formularono e progettarono il loro modello a doppia elica. 

IL CODICE DELLA VITA 

Tutto cominciò negli anni Quaranta quando ormai i dubbi sull'esistenza dei geni erano definitivamente

scomparsi. Grazie ai progressi ottenuti nel campo della genetica si sapeva che questi erano contenuti nei cromosomi; una svolta decisiva si ebbe quando gli scienziati si resero conto del fatto che i cromosomi portavano al loro interno un'enorme quantità di informazioni ereditarie. 

I cromosomi sono formati da atomi disposti, a loro volta, in molecole. Alcuni interrogativi sui cromosomi diedero il via all'immensa ricerca di cui si occupa il campo della genetica molecolare. Furono effettuate numerose analisi chimiche e dalle prime scaturì che il cromosoma eucariote è costituito da acido deossiribonucleico (meglio conosciuto come DNA) e da proteine; questi due protagonisti del cromosoma sono presenti in esso in quantità più o meno uguali. Le proteine erano le "candidate perfette" al ruolo di "materiale genetico", ma col passare del tempo tutto cambiò...

E' vero ne abbiamo già parlato precedentemente del DNA, ma è bene sempre ricordare alcune cose fondamentali. Noi del DNA sappiamo che: 

• è un polimero formato solamente da quattro diversi tipi di nucleotidi;
• esso venne isolato per la prima volta dal medico tedesco F. Miescher nel 1869;
• inizialmente non venne considerato come portatore del materiale genetico e fu preso in considerazione dopo lunghe ricerche effettuate sui virus che aggrediscono i batteri (batteriofagi);
• il DNA entra nella cellula ed è in grado di dirigere le informazioni;
• (naturalmente il resto delle informazioni sono contenute nel mio post e spiegate meglio nel sito il DNA.

Con il passare del tempo si ebbero conferme sul fatto che il DNA avesse il ruolo di trasmettere le informazioni genetiche. Questo fu confermato dal biologo molecolare statunitense A. Mirsky che fu in grado di dimostrare che le cellule somatiche presenti in una qualsiasi specie di organismi contengono uguali quantità di DNA; i gameti, invece, ne contengono l'esatta metà. Infine il biochimico E. Chargaff analizzando il contenuto di purine e pirimidine si rese conto che le basi azotate sono presenti in proporzioni uguali soltanto negli individui di una stessa specie.

IL DNA: LA SUA STRUTTURA

I due scienziati, che ottennero il premio nobel, non fecero altro (come già accennato) che mettere insieme i dati raccolti da altri colleghi. Nello stesso periodo, infatti, L. Pauling, dopo aver dimostrato che le proteine potevano avere anche forma elicoidale, avanzò l'ipotesi che il DNA potesse avere una struttura simile. 

Questa ipotesi venne poi confermata dagli studi ai raggi X effettuati da M. Wilkins e R. Franklin. Vi erano anche dei dati di E. Chargaff che indicavano la proporzione dei nucleotidi contenuti nel DNA.

Coloro che lavorarono alla scoperta di Watson e Crick:

L. Pauling

M. Wilkins

E. Chargaff

R. Franklin

Grazie a tutti i dati raccolti, Watson e Crick furono in grado di dedurre che il DNA è una doppia elica mooolto lunga e spiralizzata.
Grazie all'immagine cerchiamo di dare alcune informazioni su questa doppia elica:  

• la distanza tra i due montanti è di 2 nanometri;
• l'elica del DNA compie un giro completo ogni 10 basi azotate circa;
• la distanza tra le basi di due nucleotidi successivi è di 0,34 nm;
• un giro completo misura 3,4 nm;
• solco maggiore = distanza tra due spire del doppio filamento;
• le basi azotate sono unite da un legame a idrogeno (un tipo di legame relativamente debole);
• ogni base forma un legame covalente con la molecola di zucchero nel tratto adiacente;
• solco minore = distanza tra i due montanti.

I due (Watson e Crick) scoprirono che i nucleotidi, posti su un unico filamento della doppia elica, potevano essere disposti in qualsiasi ordine. Con questo dimostrarono che il DNA aveva tutti i requisiti per contenere il materiale genetico. Essendo, infatti, una molecola di DNA lunga migliaia di nucleotidi, è possibile ottenere un numero enorme di molecole diverse tra loro, grazie alle migliaia di sequenze di basi azotate possibili.
Da questo nuovissimo modello del DNA emerge che, lungo una catena della doppia elica i nucleotidi sono disposti in un ordine sparso, ma la loro sequenza determina l'ordine dei nucleotidi dell'altra catena, visto che le basi azotate sono complementari. Infatti, i due scienziati dimostrarono che l'adenina poteva legarsi solo con la timina mediante due legami a idrogeno A=T e la guanina soltanto con la citosina formando tre legami a idrogeno G=C. Dimostrarono che i filamenti hanno direzione antiparallela; in ogni filamento, ciascun gruppo fosfato è preceduto e seguito da una molecola di zucchero. Da una parte il gruppo fosfato si lega al quinto atomo di carbonio della molecola, mentre dall'altra si lega al terzo atomo.
Un requisito fondamentale del materiale genetico è la capacità di portare informazioni, grazie a questo modello si riuscì a capire in che modo la molecola del DNA potesse trasportare le informazioni genetiche: queste sono scritte nella sequenza di basi azotate e qualunque sequenza di basi azotate è possibile. Si capisce, quindi, come il DNA possa contenere le "istruzioni" per l'infinita diversità degli esseri viventi.

CHE COSA COMPLICATA LA DUPLICAZIONE DEL DNA


Caratteristica fondamentale del materiale genetico è la capacità di ottenere copie esatte di se stesso.

Al momento della duplicazione, la molecola si apre lungo la linea mediana come una cerniera lampo, mentre le basi appaiate si separano a livello di legami a idrogeno (H).



I due filamenti che fungono da stampo si separano. Ciascuno dirige la sintesi di un nuovo filamento complementare che avviene grazie all'utilizzo dei nucleotidi già presenti nella cellula.
Ogni filamento forma una copia esatta di quello a cui era appaiato originariamente.

La duplicazione del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare. E' l'evento portante della duplicazione cromosomica.
Necessita di un gran numero di enzimi differenti, ognuno specifico per caratterizzare una particolare fase del processo.



INIZIO: La duplicazione inizia sempre da una specifica sequenza di nucleotidi (detta origine della duplicazione) e richiede particolari proteine di attivazione ed enzimi che siano in grado di aprire la doppia elica. Quando questo accade, delle particolari proteine si attaccano ai filamenti per tenerli separati.
SINTESI DEL FILAMENTO: Questa fase entra in gioco quando la DNA polimerasi comincia ad agire. La regione in cui avviene la sintesi è chiamata bolla di duplicazione. Su entrambi gli estremi dei filamenti si formano due Y chiamate con il nome di forcella di duplicazione. Viene detta bidirezionale perché avviene in due sensi opposti rispetto all'origine. Inoltre, la duplicazione del DNA è detta semi-conservativa perché, quando la sintesi è terminata, le due catene a doppio filamento si separano in due nuove eliche (costituite da un filamento vecchio e uno nuovo).


Quando la molecola di DNA inizia a duplicarsi, su ogni filamento in via di formazione l'enzima DNA polimerasi comincia ad aggiungere nuovi nucleotidi complementari a partire da una sequenza provvisoria, chiamata di innesco.

Il primer viene sintetizzato e inserito sul filamento stampo del DNA grazie all'enzima DNA primasi. Di norma, tale sequenza è formata da circa una dozzina di nucleotidi di RNA ed è indispensabile perché l'enzima DNA polimerasi altrimenti non riuscirebbe ad entrare in azione e posizionare i nuovi nucleotidi. 

Questi nucleotidi, presenti nella cellula, posseggono inizialmente tre gruppi fosfato (deossiribonucleotidi trifosfato, dNTP). Al momento dell'inserimento, la DNA polimerasi spezza il legame covalente tra il primo e il secondo gruppo fosfato, fornendo l'energia necessaria per unire i nucleotidi adiacenti. 

Un filamento, che ha direzione da 3' a 5', può allungarsi in maniera continua senza interruzioni. Esso è detto filamento guida. L'altro filamento, quello che ha direzione da 5' a 3', è chiamato filamento in ritardo. Viene assemblato a ritroso, in modo discontinuo, sotto forma di singoli segmenti assemblati. 

Questi sono detti frammenti di Okazaki, sono lunghi 100-200 nucleotidi nelle cellule eucariote e 10 volte tanto in quelle procariote. 

Ritornando al nostro discorso, possiamo riprendere il confronto tra filamento guida (molto più simpatico e semplice) e filamento in ritardo.

Sul filamento guida il primer per la DNA polimerasi è unico e si trova all'inizio del filamento da duplicare.

Sul filamento in ritardo la faccenda si complica! Infatti, su questo filamento i primer a cui le DNA polimerasi si devono attaccare sono molteplici e si trovano di volta in volta sempre in prossimità della forcella di duplicazione. Dopo essere state utilizzate le sequenze di innesco vengono eliminate e sostituite con il DNA definito. I vari frammenti sono legati insieme dall'enzima DNA ligasi in modo che anche questo filamento possa assumere un andamento continuo.


Un aspetto significativo della duplicazione del DNA è  che diversi tipi di DNA polimerasi hanno anche la funzione di correggere alcuni errori.
Le DNA polimerasi sono in grado di aggiungere nucleotidi al filamento solo se i nucleotidi già inseriti e appaiati correttamente ai loro nucleotidi complementari sul filamento stampo.
La capacità di leggere le sequenze e di rimuovere i nucleotidi, che non sono appaiati in modo corretto è detta proofreading.

Oltre alla DNA polimerasi, altri enzimi si occupano controllando costantemente la doppia elica del DNA della cellula. Questi sono chiamati enzimi riparatori.
Ogni volta che incontrano una coppia di nucleotidi non esattamente appaiati, essi possono operare un taglio nel punto in cui è presente un errore e sostituire il nucleotide sbagliato con  quello giusto.
Le cellule dispongono anche di un importante numero di meccanismi in grado di riparare tratti di DNA che hanno subito una mutazione.

Riparazione diretta	L’enzima di riparazione riconosce l’errore nel DNA e lo corregge direttamente.
Riparazione per taglio di basi oppure di nucleotidi	La porzione di un filamento con una base o un nucleotide errato viene rimossa. Il filamento rimanente di DNA viene usato come stampo per sintetizzare la nuova porzione corretta.
Riparazione di un appaiamento errato (mediato da gruppi metile)	Sistema simile al precedente; l’unica differenza che l’errore si trova nell’appaiamento delle due basi. La porzione scorretta viene rimossa e il filamento di DNA complementare viene usato come stampo per sintetizzare la nuova porzione corretta.

LA PCR

Nel 1986, il biochimico statunitense K. Mullis (1944-) mise a punto un metodo di laboratorio per riprodurre copie multiple di di frammenti di DNA. Questo processo avveniva tramite una reazione a catena della polimerasi, meglio conosciuta come PCR.

Questo processo è in grado di sintetizzare un piccolissimo campione di DNA e di sintetizzare in vitro milioni di copie un suo specifico segmento.





Il metodo si basa sulla ripetizione continua di tre reazioni:

1. FASE DI DENATURAZIONE: la soluzione viene riscaldata in modo che i due filamenti della doppia elica di DNA si separino;
2. FASE DI ANNEALING: la soluzione viene raffreddata per permettere ai primer di attaccarsi alle loro sequenze complementari;
3. FASE DI ALLUNGAMENTO: le molecole di DNA polimerasi cominciano ad aggiungere nucleotidi a partire dai siti in cui si sono attaccate le sequenze di innesco.

Il funzionamento ottimale di questa tecnica dipende dall'utilizzo di una DNA polimerasi particolare (Taq-polimerasi) che non si denatura a seguito dei molti cicli di riscaldamento e raffreddamento a cui viene sottoposta.
Il metodo PCR viene usato per la diagnosi prenatale delle malattie genetiche, per la ricerca di infezioni causate da virus latenti e per produrre grossi quantitativi di sequenze selezionate di DNA umano in un brevissimo lasso di tempo.

I CROMOSOMI

In altro cromosomi della cellula eucariote, in basso il cromosoma della cellula procariote.

Il patrimonio genetico procariote è formato da un unico cromosoma a forma, genericamente, circolare.

E' costituito da ima sola molecola di DNA a doppio filamento che forma un anello.

All'interno della cellula, il cromosoma è compattato dentro una struttura di forma irregolare, chiamata nucleoide.

Il patrimonio genetico della cellula eucariote ha molte caratteristiche che lo distinguono da quello presente nelle cellule procariote:

• il genoma degli eucarioti è suddiviso in più cromosomi e contiene una quantità di DNA moolto più grande;
• presenta una stretta associazione fra il DNA e diverse proteine che hanno un ruolo importante nella struttura cromosomica;
• contiene un elevato numero di segmenti di DNA ripetuti;
• è molto più complesso nell'organizzazione delle sequenze di DNA che forniscono informazione alla cellula e nella regolazione dell'attività enzimica.

Nel nucleo delle cellule eucariote il DNA si trova sempre combinato con le proteine; l'insieme di DNA e proteine costituisce la cromatina. Esistono due tipi di cromatina:

• l'eucromatina, risulta più dispersa e si colora debolmente; nell'interfase, invece, è prevalente in molte regioni del DNA e i geni possono trasmettere informazioni;
• l'eterocromatina, risulta più condensata e si colora più intensamente; sempre nell'interfase, questa risulta localizzata solo in quelle regioni dei cromosomi in cui non ci sono geni attivi oppure "silenti". 

Durante la fase di divisione della cellula, tutta la cromatina si presenta in una forma più densa e condensata per consentire un più agevole movimento dei cromosomi. 

Nella cromatina le proteine più abbondanti appartengono a una classe di piccoli polipeptidi detti istoni. 

Gli istoni (basici) hanno carica positiva e sono attratti dal DNA (acido) carico negativamente. Sono i principali responsabili del ripiegamento e dell'avvolgimento del DNA. 

Ci sono cinque diversi tipi di istoni (H1, H2A, H2B, H3 e H4) presenti in quantità enormi: in ogni cellula vi sono circa 30 milioni di molecole dell'istone H1 e circa 60 per ciascuno degli altri quattro tipi. 

Le unità fondamentali in cui viene compattata la cromatina sono i nucleosomi. Ogni nucleosoma è formato da una parte centrale (costituita da otto molecole di istoni) intorno alla quale si avvolge due volte il filamento di DNA. Il quinto tipo di istone H1 si trova lungo il DNA.

Ogni cromosoma presente nel nucleo si colloca in una sua propria regione che viene detta territorio cromosomico. Altre proteine associate al cromosoma sono gli enzimi impiegati nella sintesi del DNA e dell'RNA, le proteine di regolazione e numerose e varie molecole che non sono ancora state isolate e identificare. A differenza degli istoni, queste proteine variano da un tipo di cellula a un altro.